Il corso si propone di fornire agli studenti una panoramica sulle principali strategie per la produzione di proteine ricombinanti in E. coli prendendo in esame nello specifico le varie problematiche connesse all'espressione, estrazione e purificazione dei prodotti ricombinanti. Saranno inoltre trattati approfonditamente i principi delle tecniche analitiche che verranno utilizzate dagli studenti durante le lezioni di laboratorio

Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine
-Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine
-Aspetti fisici della separazione elettroforetica
-Gel di poliacrilammide
-SDS-PAGE
-Sistema gel/tampone di tipo discontinuo
-Metodi di colorazione
-Western blotting
-Immunoblotting
-PAGE in condizioni native
-EMSA

Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine
-Assorbimento a 280 nm
-Metodo Bradford
-Metodo Lowry

E. coli come sistema di espressione
-Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti
-Caratteristiche di un sistema di espressione
-Vettori di espressione plasmidici
Sito multiplo di clonaggio e codon usage
Origine di replicazione e copie plasmidiche
I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, PL,T7)
I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi
Il Ribosome Binding Site

Strategie per prevenire la proteolisi in vivo
-Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare
-Manipolazione delle condizioni di fermentazione
-Ingegnerizzazione dell'ospite
-Ingegnerizzazione del prodotto

Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione
-Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione
-Manipolazione delle condizioni di fermentazione
-Ingegnerizzazione dell'ospite
I ceppi "ossidanti"
Co-espressione con chaperon molecolari
-Ingegnerizzazione del prodotto
La secrezione nel periplasma
Le proteine di fusione (MBP, GST, SUMO)
-I tag di fusione e il tagging combinatoriale

Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale
-Crioconservazione della biomassa
-Metodi di rottura delle cellule batteriche
-Componenti del tampone di estrazione

Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione
-Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione
-Metodi di refolding in vitro

Sviluppo di un protocollo di purificazione
-Chiarificazione dell'estratto
-Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione
-Sviluppo di un saggio specifico
-Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento
-Resa e grado di purificazione

La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione
-La matrice
-Il ligando
-Il braccio spaziatore
-Tecniche di eluizione

Caratterizzazione del prodotto proteico
Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche
Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici
-Test del coniglio
-Test LAL (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)
-Test di rilascio delle citochine
Tecniche di eliminazione di contaminanti endotossinici
Anticorpi mono- e policlonali
Strategie di immunizzazione
Tecniche di purificazione di immunoglobuline
Tecniche ELISA
-ELISA diretto
-ELISA indiretto
-ELISA semidiretto

Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio
Preparazione delle soluzioni per SDS-PAGE e allestimento gel
Determinazione della retta di calibrazione di BSA e IgG con metodo Bradford
Terreni e soluzioni per la crescita batterica
Tamponi per l'estrazione di proteine solubili e insolubili
Crescita batterica e induzione
Rottura delle cellule ed estrazione delle proteine
Analisi SDS-PAGE degli indotti
Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità
Analisi SDS-PAGE e Western-Immunoblotting delle frazioni cromatografiche
Test LAL, metodica gel clot
Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto

This laboratory course introduces students to the production, processing, and analysis of recombinant proteins from prokaryotic sources. Concepts include the expression of recombinant genes in host cells, protein purification, and protein analysis.

Program
The course is intended for students who wish to learn about the process of production of recombinant proteins particularly focusing on E.coli as a production host. The course includes lectures on techniques used for heterologous protein production and purification as well as hands-on practical work in the laboratory.
Lecture topics include:
scopes for the production of recombinant proteins; E. coli as production host; expression vectors; strategies to prevent in vivo proteolysis; strategies to prevent the formation of inclusion bodies: manipulation of the fermentation conditions, product engineering, host engineering; cell disruption, extraction and lysate clarification; solubilization of proteins from inclusion bodies and refolding in vitro; how to set up a purification protocol: phases, objectives, selection and logical combination of purification techniques; affinity chromatography for the purification of fusion proteins; electrophoretic separation techniques for the analysis of proteins; spectrophotometric protein assays.
Laboratory training covers all steps of production, purification and characterization of a recombinant protein fused to a GST tag and expressed in E. coli cells, ranging from cells inoculation and growth, protein purification by affinity chromatography, and protein analysis by SDS-PAGE and Western blotting.
The characterization phase will be completed with the LAL tests execution for determining of contaminants such as pyrogens, in recombinant proteins and ELISA assays for evaluating biological activity of the recombinats products

Modalità didattiche

Lezioni frontali e in laboratorio

Obblighi

Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle ore di lezione in laboratorio. 

 

 

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Obblighi