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LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE II
LABORATORY OF BIOTECHNOLOGY II

Tecniche di clonaggio genico in un vettore di espressione procariotico
Techniques of gene cloning into a prokaryotic expression vector

A.A. CFU
2015/2016 8
Docente Email Ricevimento studenti
Marzia Bianchi Previo appuntamento telefonico (0722 305201) o contatto via e-mail.

Assegnato al Corso di Studio

Giorno Orario Aula

Obiettivi Formativi

Il corso si propone di trasmettere le conoscenze teoriche e le competenze pratiche delle più comuni tecniche di clonaggio del DNA, utilizzate per studiare la struttura e la funzione dei geni (dal DNA alla proteina). Al termine del corso, gli studenti dovranno dimostrare di aver acquisito una buona conoscenza della tecnologia del DNA ricombinante e di essere in grado di progettare e realizzare un esperimento di clonaggio in piena autonomia.

Programma

Attività di laboratorio
1. Definizione dell'obiettivo del clonaggio e progettazione della strategia di clonaggio.
1.1 Selezione del gene da clonare e del vettore di clonaggio.
1.2 Selezione degli enzimi di restrizione da utilizzare e progettazione di primers degenerati.
2. Isolamento di RNA totale dalla fonte di partenza selezionata.
2.1 Dosaggio spettrofotometrico e analisi elettroforetica dell'RNA estratto.
3. Sintesi di cDNA da RNA totale, tramite trascrizione inversa (RT).
4. PCR con primers degenerati specifici per l'inserto da clonare.
4.1 Verifica del prodotto di PCR su gel di agaroso.
4.2 Purificazione del prodotto di PCR.
5. Ligasi del prodotto di PCR con un vettore plasmidico, tramite la strategia TA cloning.
6. Trasformazione di cellule E. coli competenti con la reazione di ligasi.
7. Screening e identificazione dei cloni ricombinanti.
7.1 PCR su colonie.
7.2 Estrazione di un clone con inserto (miniprep DNA plasmidico).
8. Trasferimento del gene target in un vettore di espressione batterico, tramite clonaggio direzionale, con enzimi di restrizione.
8.1 Digestione inserto e vettore con enzimi di restrizione.
8.2 Reazione di ligasi.
8.3 Trasformazione di un ceppo di clonaggio competente.
8.4 Screening dei ricombinanti.
9. Trasformazione del costrutto di espressione in cellule ospiti adatte per l'espressione della proteina ricombinante.
9.1 Screening, propagazione e conservazione dei cloni ricombinanti.


Lezioni frontali (a supporto delle attività di laboratorio)
1. Clonaggio del DNA: overview su enzimi, vettori, cellule ospiti.
1.1 Enzimi per il clonaggio del DNA: nucleasi, ligasi, polimerasi, fosfatasi.
1.2 Vettori di clonaggio per E. coli e per cellule eucariotiche: plasmidi, fagi, cosmidi, BAC, YAC, vettori "navetta".
1.3 Sistemi biologici della biotecnologia molecolare: batteri, lieviti, eucarioti superiori.
2. Introduzione di DNA in cellule vive.
2.1 La trasformazione genetica dei procarioti.
3. Costruzione e screening delle Genoteche.
3.1 Preparazione di DNA genomico e di cDNA per la generazione di genoteche.
3.2 Strategie di screening delle genoteche.
3.3 Colony e plaque hybridization: produzione di sonde marcate
3.4 Purificazione di vettori ricombinanti e analisi tramite enzimi di restrizione e/o sequenziamento.
4. Reazione a catena della polimerasi (PCR) come alternativa al clonaggio "cell-based".
5. Tecniche di base della tecnologia del DNA ricombinante.
5.1 Isolamento di acidi nucleici.
5.2 Quantificazione di acidi nucleici: dosaggio con spettrofotometro standard e con NanoDrop.
5.3 Elettroforesi su gel di agaroso e sizing da gel.
5.4 Trasferimento e immobilizzazione di acidi nucleici dal gel a un supporto solido (blotting).
5.5 Ibridazione degli acidi nucleici con sonde marcate.
5.6 Sequenziamento del DNA.
5.7 Preparazione di piastre di LB agar e streaking di batteri.
5.8 Inoculo di batteri in terreno liquido e preparazione di stock in glicerolo per la conservazione a lungo termine.
6. Introduzione ai vettori di espressione.

Eventuali Propedeuticità

Per la comprensione dei contenuti del corso è richiesta una buona conoscenza di Biologia molecolare di base.

Risultati di Apprendimento (Descrittori di Dublino)

Gli studenti dovranno acquisire familiarità con le tecniche più comuni utilizzate per clonare e studiare i geni.

Materiale Didattico

Il materiale didattico predisposto dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

Modalità Didattiche, Obblighi, Testi di Studio e Modalità di Accertamento

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology. 
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. BIOTECHNOLOGY, Academic Cell, Elsevier Inc, 2015.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Modalità di
accertamento

Esame orale.
Valutazione del quaderno di laboratorio.

Informazioni Aggiuntive per Studenti Non Frequentanti

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology. 
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. BIOTECHNOLOGY, Academic Cell, Elsevier Inc, 2015.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Modalità di
accertamento

Esame orale.
Valutazione del quaderno di laboratorio.

Note

L'esame e la bibliografia potranno essere in lingua inglese su richiesta dello studente.

« torna indietro Ultimo aggiornamento: 08/02/16


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