Il corso é mirato a fornire agli studenti una panoramica sui processi di produzione delle proteine ricombinanti, focalizzando particolarmente l'attenzione su E. coli come sistema di espressione. Nello specifico il corso é finalizzato all'acquisizione teorica, ma soprattutto pratica con lezioni in laboratorio, delle strategie sperimentali e delle tecniche impiegate per l'espressione, estrazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti. Le proteine ricombinanti sono prodotti biotecnologici ampiamente utilizzati sia come reagenti di laboratorio che come diagnostici e terapeutici in campo biomedicale, pertanto la conoscenza dei processi, nonchè la padronanza delle tecniche necessari per la loro produzione, costituiscono elementi formativi essenziali all'esercizio della professione di Biotecnologo.

L'insegnamento affronterà i seguenti argomenti secondo l'ordine sottoindicato.

1. Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine
1.1 Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine
1.2 Aspetti fisici della separazione elettroforetica
1.3 Gel di poliacrilammide
1.4 SDS-PAGE
1.5 Sistema gel/tampone di tipo discontinuo
1.6 Metodi di colorazione
1.7 Western immunoblotting
1.8 PAGE in condizioni native
1.9 Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)
2. Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine
2.1 Assorbimento a 280 nm
2.2 Metodo Bradford
2.3 Metodo Lowry
3. Escherichia coli come sistema di espressione
3.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti
3.2 Caratteristiche di un sistema di espressione
3.3 Vettori di espressione plasmidici
3.3.1 Sito multiplo di clonaggio e codon usage
3.3.2 Origine di replicazione e copie plasmidiche
3.3.3 I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, PL,T7)
3.3.4 I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi
3.3.5 Il Ribosome Binding Site
4. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo
4.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare
4.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
4.3 Ingegnerizzazione dell'ospite
4.4 Ingegnerizzazione del prodotto
5. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione
5.1 Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione
5.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
5.3 Ingegnerizzazione dell'ospite
5.3.1 I ceppi "ossidanti"
5.3.2 Co-espressione con chaperon molecolari
5.4 Ingegnerizzazione del prodotto
5.4.1 La secrezione nel periplasma
5.4.2 Le proteine di fusione (MBP, GST, SUMO)
5.5 I tag di fusione
6. Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale
6.1 Crioconservazione della biomassa
6.2 Metodi di rottura delle cellule batteriche
6.3 Componenti del tampone di estrazione
7. Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione
7.1 Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione
7.2 Metodi di refolding in vitro
8. Sviluppo di un protocollo di purificazione
8.1 Chiarificazione dell'estratto
8.2 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione
8.3 Sviluppo di un saggio specifico
8.4 Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento
8.5 Resa e grado di purificazione
9. La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione
9.1 La matrice
9.2 Il ligando
9.3 Il braccio spaziatore
9.4 Tecniche di eluizione
10. Caratterizzazione del prodotto proteico
10.1 Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche
10.2 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici
10.2.1 Test del coniglio
10.2.2 Test del Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)
10.2.3 Test di rilascio delle citochine
10.3 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici
10.4 Anticorpi mono- e policlonali
10.5 Strategie di immunizzazione
10.6 Tecniche di purificazione delle immunoglobuline
10.7 Tecniche ELISA
10.7.1 ELISA diretto
10.7.2 ELISA indiretto
10.7.3 ELISA competitivo
11. Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio
11.1 Preparazione delle soluzioni per SDS-PAGE e allestimento gel
11.2 Determinazione della retta di calibrazione della albumina bovina con metodo Bradford
11.3 Terreni e soluzioni per la crescita batterica e tamponi per l'estrazione di proteine solubili e insolubili
11.4 Crescita batterica e induzione
11.5 Analisi SDS-PAGE degli indotti
11.6 Rottura delle cellule, estrazione delle proteine e frazionamento
11.7 Analisi SDS-PAGE della frazione solubile ed insolubile
11.8 Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità
11.9 Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche
11.10 Taglio enzimatico del partner di fusione
11.11 Analisi SDS-PAGE e Western Immunoblotting del prodotto ricombinante
11.12 Test LAL, metodica gel clot
11.13 Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto

nessuna

Lo studente dovrà mostrare di conoscere e avere compreso le nozioni riguardanti le tecniche di laboratorio e le strategie sperimentali più comunemente utilizzate per l'espressione, purificazione e caratterizzazione di proteine ricombinanti; di essere in grado di comprendere ed eseguire un protocollo sperimentale, avvalendosi delle basi teoriche acquisite e della strumentazione presente in laboratorio; di poter analizzare criticamente i risultati ottenuti e individuare problemi e soluzioni; di essere in grado di descrivere e commentare i risultati sperimentali; di sviluppare un protocollo di espressione e purificazione in maniera autonoma.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

Lezioni di supporto alla didattica (20 ore) tenute dalla Dott.ssa Dominici

Modalità didattiche

Lezioni frontali e in laboratorio. Il calendario delle lezioni in laboratorio verrà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle lezioni.

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

altro materiale di studio e/o approfondimento (diapositive delle lezioni, protocolli, review in lingua inglese) saranno forniti durante il corso.

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.