Il corso si propone di trasmettere le conoscenze teoriche e le competenze pratiche delle più comuni tecniche di clonaggio del DNA, utilizzate per studiare la struttura e la funzione dei geni (dal DNA alla proteina).  Le lezioni in aula forniranno una overview dei vari vettori di clonaggio, delle cellule ospiti e delle strategie di screening comunemente utilizzate nelle tecnologie del DNA ricombinante. Durante le lezioni di laboratorio sarà messa in pratica una strategia sperimentale finalizzata al clonaggio di un gene e alla successiva produzione di proteina ricombinante in E. coli.

Attività di laboratorio
1. Definizione dell'obiettivo del clonaggio e progettazione della strategia di clonaggio.
1.1 Selezione del gene da clonare e del vettore di clonaggio.
1.2 Selezione degli enzimi di restrizione da utilizzare e progettazione di primers degenerati.
2. Isolamento di RNA totale dalla fonte di partenza selezionata.
2.1 Dosaggio spettrofotometrico e analisi elettroforetica dell'RNA estratto.
3. Sintesi di cDNA da RNA totale, tramite trascrizione inversa (RT).
4. PCR con primers degenerati specifici per l'inserto da clonare.
4.1 Verifica del prodotto di PCR su gel di agaroso.
4.2 Purificazione del prodotto di PCR.
5. Ligasi del prodotto di PCR con un vettore plasmidico, tramite la strategia TA cloning.
6. Trasformazione di cellule E. coli competenti con la reazione di ligasi.
7. Screening e identificazione dei cloni ricombinanti.
7.1 PCR su colonie.
7.2 Estrazione di un clone con inserto (miniprep DNA plasmidico).
8. Trasferimento del gene target in un vettore di espressione batterico, tramite clonaggio direzionale, con enzimi di restrizione.
8.1 Digestione inserto e vettore con enzimi di restrizione.
8.2 Reazione di ligasi.
8.3 Trasformazione di un ceppo di clonaggio competente.
8.4 Screening dei ricombinanti.
9. Trasformazione del costrutto di espressione in cellule ospiti adatte per l'espressione della proteina ricombinante.
9.1 Screening, propagazione e conservazione dei cloni ricombinanti.
10. Principali strumenti bioinformatici a supporto delle tecniche di clonaggio.

Lezioni frontali (a supporto delle attività di laboratorio)
1. Clonaggio del DNA: overview su enzimi, vettori, cellule ospiti.
1.1 Enzimi per il clonaggio del DNA: nucleasi, ligasi, polimerasi, fosfatasi.
1.2 Vettori di clonaggio per E. coli e per cellule eucariotiche: plasmidi, fagi, cosmidi, BAC, YAC, vettori "navetta".
1.3 Sistemi biologici della biotecnologia molecolare: batteri, lieviti, eucarioti superiori.
2. Introduzione di DNA in cellule vive.
2.1 La trasformazione genetica dei procarioti.
3. Costruzione e screening delle Genoteche.
3.1 Preparazione di DNA genomico e di cDNA per la generazione di genoteche.
3.2 Strategie di screening delle genoteche: colony e plaque hybridization.
3.3: Produzione di sonde marcate
3.4 Purificazione di vettori ricombinanti.
3.5 Analisi tramite enzimi di restrizione.
3.6 Sequenziamento del DNA.
4. Reazione a catena della polimerasi (PCR) come alternativa al clonaggio "cell-based".
5. Tecniche di base della tecnologia del DNA ricombinante.
5.1 Isolamento di acidi nucleici.
5.2 Quantificazione di acidi nucleici: dosaggio con spettrofotometro standard e con NanoDrop (con esercizi).
5.3 Elettroforesi su gel di agaroso e sizing da gel.
5.4 Preparazione di piastre di LB agar e streaking di batteri.
5.5 Inoculo di batteri in terreno liquido e preparazione di stock in glicerolo per la conservazione a lungo termine.
6. Introduzione ai vettori di espressione.
 

Per la comprensione dei contenuti del corso è richiesta una buona conoscenza di Biologia molecolare di base.

Conoscenza e capacità di comprensione.  Al termine del corso, gli studenti avranno acquisito la conoscenza teorico-pratica delle più comuni tecniche di laboratorio utilizzate per purificare e analizzare gli acidi nucleici; dei vari tipi di vettori e cellule ospiti impiegate per il clonaggio genico, e delle principali strategie di screening e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti.

Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Gli studenti dovranno dimostrare di  essere in grado di comprendere un protocollo di laboratorio  e metterlo in pratica e di progettare e realizzare un esperimento di clonaggio in piena autonomia.

Autonomia di giudizio. Gli studenti dovranno essere in grado di analizzare criticamente i risultati ottenuti e di discuterli pubblicamente.

Abilità comunicative. Gli studenti dovranno acquisire una proprietà di linguaggio scientifico adeguata assumendo un atteggiamento partecipativo e critico agli argomenti delle lezioni in aula e in laboratorio.

Capacità di apprendimento. Gli studenti dovranno avere la capacità di aumentare autonomamente la propria conoscenza teorico-pratica di nuovi aspetti emergenti nell’ambito delle biotecnologie molecolari.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare. Il calendario delle lezioni di laboratorio sarà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio e delle lezioni in aula, segnalate, che hanno obbligo di frequenza.

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale del Corso di Formazione Generale sulla Sicurezza per i Lavoratori e del Corso sulla Sicurezza nel Laboratorio Chimico e Biologico.

Testi di studio

• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology.
• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2017 (NEW!).

Per approfondimento:

• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. BIOTECHNOLOGY, Academic Cell, Elsevier Inc, 2015.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.
 

Modalità di
accertamento

Esame orale.
Valutazione del quaderno di laboratorio.

L’esame consta di quattro domande su diversi argomenti del programma, di cui due inerenti alle esperienze svolte in laboratorio, ed è volto a determinare le conoscenze acquisite, il loro grado di approfondimento e la capacità dello studente di collegare diverse tematiche fra di loro e di risolvere problemi pratici. Sarà valutata anche la capacità di esporre gli argomenti con un linguaggio scientifico appropriato. Al voto finale concorrono l’esame orale e la valutazione del quaderno di laboratorio.
 

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare.

Il calendario delle lezioni di laboratorio sarà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio e delle lezioni in aula, segnalate, che hanno obbligo di frequenza.

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale del Corso di Formazione Generale sulla Sicurezza per i Lavoratori e del Corso sulla Sicurezza nel Laboratorio Chimico e Biologico.

Testi di studio

• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology.
• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2017 (NEW!).

Per approfondimento:

• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. BIOTECHNOLOGY, Academic Cell, Elsevier Inc, 2015.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.
 

Modalità di
accertamento

Esame orale.
Valutazione del quaderno di laboratorio.

L’esame consta di quattro domande su diversi argomenti del programma, di cui due inerenti alle esperienze svolte in laboratorio, ed è volto a determinare le conoscenze acquisite, il loro grado di approfondimento e la capacità dello studente di collegare diverse tematiche fra di loro e di risolvere problemi pratici. Sarà valutata anche la capacità di esporre gli argomenti con un linguaggio scientifico appropriato. Al voto finale concorrono l’esame orale e la valutazione del quaderno di laboratorio.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Parte del corso sarà erogata in lingua inglese, su richiesta degli studenti.
L'esame e la bibliografia potranno essere in lingua inglese su richiesta dello studente.