LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE III
LABORATORY OF BIOTECHNOLOGY III
Espressione, purificazione e caratterizzazione di proteine ricombinanti
Expression, purification and characterization of recombinant proteins
A.A. | CFU |
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2022/2023 | 8 |
Docente | Ricevimento studentesse e studenti | |
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Rita Crinelli | Da lunedì a venerdì previo appuntamento tramite mail |
Didattica in lingue straniere |
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Insegnamento con materiali opzionali in lingua straniera
Inglese
La didattica è svolta interamente in lingua italiana. I materiali di studio e l'esame possono essere in lingua straniera. |
Assegnato al Corso di Studio
Giorno | Orario | Aula |
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Giorno | Orario | Aula |
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Obiettivi Formativi
Il corso é mirato a fornire agli studenti una panoramica sui processi di produzione delle proteine ricombinanti, focalizzando particolarmente l'attenzione su E. coli come sistema di espressione. Nello specifico il corso é finalizzato all'acquisizione teorica, ma soprattutto pratica con lezioni in laboratorio, delle strategie sperimentali e delle tecniche impiegate per l'espressione, estrazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti. Le proteine ricombinanti sono prodotti biotecnologici ampiamente utilizzati sia come reagenti di laboratorio che come diagnostici e terapeutici in campo biomedicale e biocatalizzatori nell'industia, pertanto la conoscenza dei processi, nonché la padronanza delle tecniche necessarie per la loro produzione, costituiscono elementi formativi essenziali all'esercizio della professione di Biotecnologo.
Programma
L'insegnamento affronterà i seguenti argomenti secondo l'ordine sottoindicato.
LEZIONI IN AULA
1. Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine
1.1 Assorbimento a 280 nm
1.2 Metodo Bradford
1.3 Metodo Lowry
1.4 Metodo BCA
2. Escherichia coli come sistema di espressione
2.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti
2.2 Caratteristiche di un sistema di espressione
2.3 Vettori di espressione plasmidici
2.3.1 Sito multiplo di clonaggio e codon usage
2.3.2 Origine di replicazione e copie plasmidiche
2.3.3 I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL,T7, pBAD)
2.3.4 I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi
2.3.5 Il Ribosome Binding Site
3. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo
3.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare
3.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
3.3 Ingegnerizzazione dell'ospite
3.4 Ingegnerizzazione del prodotto
4. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione
4.1 Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione
4.2 Applicazioni Biotecnologiche dei corpi di inclusione
4.3 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
4.4 Ingegnerizzazione dell'ospite
4.4.1 I ceppi "ossidanti"
4.4.2 Co-espressione con chaperon molecolari
4.5 Ingegnerizzazione del prodotto
4.5.1 La secrezione nel periplasma
4.5.2 Le proteine di fusione (MBP, GST, UB, SUMO)
4.5.2.1 Uso delle proteasi per la rimozione del partner di fusione
4.5.2.2 I peptidi autotaglianti
4.6 I tag di fusione
4.6.1 Tag combinatoriale
5. Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione
5.1 Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione
5.2 Metodi di refolding in vitro
6. Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine
6.1 Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine
6.2 Aspetti fisici della separazione elettroforetica
6.3 Gel di poliacrilammide
6.4 SDS-PAGE
6.5 Sistema gel/tampone di tipo discontinuo
6.6 Metodi di colorazione
6.7 PAGE in condizioni native
6.8 Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)
6.9 Western blotting
6.10 Immunoblotting
6.10.1 Bloccaggio
6.10.2 Rilevazione diretta e indiretta
6.10.3 Marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione
7. Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale
7.1 Crioconservazione della biomassa
7.2 Metodi di rottura delle cellule batteriche
7.3 Componenti del tampone di estrazione
8. Sviluppo di un protocollo di purificazione
8.1 Chiarificazione dell'estratto
8.2 Tecniche di centrifugazione
8.3 Salting in e salting out
8.4 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione
8.5 Sviluppo di un saggio specifico
8.6 Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento
8.7 Resa e grado di purificazione
9. La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione
9.1 La matrice
9.2 Il ligando
9.3 Il braccio spaziatore
9.4 Tecniche di eluizione
9.5 Ligandi biologici e strutturali utilizzati per la purificazione di proteine ricombinanti
10. Caratterizzazione del prodotto proteico
10.1 Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche
10.2 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici
10.2.1 Test del coniglio
10.2.2 Test del Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)
10.2.3 Test di rilascio delle citochine
10.3 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici
10.4 Anticorpi mono- e policlonali
10.5 Strategie di immunizzazione
10.6 Tecniche di purificazione delle immunoglobuline
10.7 Tecniche ELISA
10.7.1 ELISA diretto
10.7.2 ELISA indiretto
10.7.3 ELISA competitivo
11. Stabilizzazione e conservazione del prodotto ricombinante
LEZIONI IN LABORATORIO
11. Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio
11.1 Dosaggio proteico a 280 nm e determinazione della retta di calibrazione dell'albumina bovina e della beta-lattoglobulina con metodo Bradford
11.2 Crescita batterica e induzione
11.3 Rottura delle cellule, estrazione delle proteine e frazionamento solubile/insolubile
11.4 Analisi SDS-PAGE dell'espressione e solubilità
11.5 Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità
11.6 Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche
11.7 Utilizzo della proteina ricombinante come substrato di un saggio enzimatico
11.8 Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto
Eventuali Propedeuticità
nessuna
Risultati di Apprendimento (Descrittori di Dublino)
D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente conoscerà le strategie più comunemente utilizzate per esprimere, purificare e caratterizzare proteine ricombinanti. In particolare, sarà a conoscenza di vantaggi e problematiche connesse all’utilizzo di E. coli come sistema di espressione e saprà come affrontare quest’ultime attraverso approcci di manipolazione delle condizioni di fermentazione o ricorrendo ad ingegnerizzazione genetica dell’ospite e/o del prodotto. Saprà come conservare la biomasssa, preparare un estratto batterico, strutturare un protocollo di purificazione. Sarà a conoscenza dei principi e dei possibili impieghi delle tecniche utilizzate in laboratorio. Sarà inoltre formato sulle più avanzate tecniche immunologiche e di rilevazione dei contaminanti endotossinici per la caratterizzazione di prodotti ricombinanti ad uso diagnostico/clinico.
D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente sarà in grado di seguire, sotto la supervisione di personale specializzato, un processo di produzione di proteine ricombinanti comprendendone tutte le fasi, dall’espressione, alla purificazione e alla caratterizzazione del prodotto. Saprà comprendere ed eseguire un protocollo sperimentale fornito, e sarà in grado di allestire un semplice protocollo autonomamente sulla base di obiettivi delineati.
D3-Autonomia di giudizio. Lo studente sarà capace di acquisire i dati, presentarli in forma grafica e criticamente commentare i risultati. Saprà individuare problematiche legate al processo di produzione e proporre soluzioni.
D4-Abilità comunicative. Lo studente saprà descrivere un processo di produzione e le tecniche impiegate, nonché commentare i risultati sperimentali utilizzando un linguaggio appropriato.
D5-Capacità di apprendimento. Lo studente avrà le basi per poter leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente saprà porre domande e fornire risposte.
Materiale Didattico
Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it
Attività di Supporto
20 ore di attività di supporto alla didattica
Modalità Didattiche, Obblighi, Testi di Studio e Modalità di Accertamento
- Modalità didattiche
Il corso prevede
Lezioni frontali (3 CFU)
Lezioni pratiche in laboratorio/aula informatica (5 CFU) con analisi ed elaborazione dei dati e loro redazione in forma grafica.
- Didattica innovativa
lezioni video (in inglese con sottotitoli in italiano) di approfondimento o ripasso da piattaforma JoVE con quiz di autovalutazione (erogati tramite link diretto su piattaforma Moodle di Ateneo)
- Obblighi
Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle lezioni in laboratorio, nonché avere caricato su blended e-learning, prima della chiusura delle liste, l'elaborato descritto in "modalità di accertamento".
Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale dei corsi online di “Formazione generale sulla sicurezza per i lavoratori” e “Sicurezza nel laboratorio Chimico e Biologico”.
Per svolgere adeguatamente le attività previste dall’insegnamento è fortemente consigliato avere superato l'esame o quantomeno seguito i corsi di Laboratorio di Biotecnologie I e Laboratorio di Biotecnologie II. E' altresì importante avere conoscenze di biochimica e chimica (inorganica, organica e analitica) di base e di Biologia Molecolare.
- Testi di studio
B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.altro materiale di studio e/o approfondimento (diapositive delle lezioni, protocolli, review in lingua inglese) saranno forniti durante il corso sulla piattaforma Moodle.
- Modalità di
accertamento Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande riguardanti le nozioni teoriche con rimandi specifici alla prassi di laboratorio (tecniche e procedure). Almeno una delle domande riguarderà nello specifico i contenuti delle lezioni in laboratorio. A tal fine gli studenti dovranno caricare su blended (in una cartella predisposta appositamente dal docente) un elaborato (in formato pdf) contenente i dati sperimentali raccolti in laboratorio, organizzati in forma di figure/grafici (specifiche indicazioni saranno fornite durante le lezioni). In sede di esame, iI docente chiederà di descrivere e commentare criticamente quanto riportato nell'elaborato secondo lo schema: scopo, procedura, risultato, commento.
Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.
- Disabilità e DSA
Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.
A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.
Informazioni aggiuntive per studentesse e studenti non Frequentanti
- Modalità didattiche
NON PREVISTO - corso con obbligo di frequenza
« torna indietro | Ultimo aggiornamento: 02/10/2022 |